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細胞養不好?這些注意事項請收好(三)


【技術文章】細胞養不好?這些注意事項請收好(三)



1、購買的細胞死亡或存活率不佳可能原因?細胞冷凍管解凍后,為何會有細胞數目太少的情形?


研究人員在細胞培養時出現存活率不佳,常見原因可歸納為:培養基使用錯誤或培養基品質不佳;血清使用錯誤或血清的品質不佳;解凍過程錯誤;冷凍細胞解凍后,加以洗滌細胞和離心;懸浮細胞誤認為死細胞;培養溫度使用錯誤;細胞置于 –80 ℃ 太久。


研究人員在冷凍細胞培養時出現細胞數目太少,大都是因為離心過程操作上的失誤,造成細胞的物理性損傷,以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心,應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。


2、收到的冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落的原因?


冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,是因熱脹冷縮的物理現象,冷凍管有可能因此而造成細胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時,均應立刻將冷凍管再一次扭緊。



3、如何選用特殊細胞系培養基?


培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在 MEM 中培養的細胞,很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長。總之,優選 MEM 做粘附細胞培養,RPMI-1640 做懸浮細胞培養是一個好的開始,各種目的無血清培養*好優選 AIM V(12005)培養基(SFM)。


4、L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎?


L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有*終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。



5、GlutaMAX-I 是什么?培養細胞如何利用 GlutaMAX-I?這個二肽有多穩定?


GlutaMAX-I 二肽是一個 L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩定的 alpha-氨基用 L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放 L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩定,即使在 121 磅** 20 分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有*小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。


6、什么培養基中可以省去加酚紅?培養基中丙酮酸鈉的作用是什么?


酚紅在培養基中被用來作為 PH 值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類**的作用(特別是雌**)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。



丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源,盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。


7、為什么目錄上說 Hank's 平衡鹽溶液 (HBS) 在空氣中使用,不需要 CO2 培養箱?HBS 和 Earle's 平衡鹽溶液 (EBS) 有什么本質的功能差別?


HBS 和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在 Eagles (2.2 g/L) 中比在 Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的 CO2 平衡,以維持溶液的 PH 值。Eagles 液在空氣水平的 CO2 中,溶液會變堿,Hanks 液在 CO2 培養箱中會變酸。如果希望在 CO2 培養箱中保存組織,需要用 Eagles 液,如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織,用 Hanks 液就可以了。


8、二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入 EDTA 的目的是什么?


二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,用 EDTA 清洗細胞,以消除來自培養基中所有的二價離子。


9、其他注意事項


o 當在無血清培養基中添加***時,降低至少在有血清培養基中所使用濃度的 50%。血清蛋白會結合和滅活一些***。在無血清培養條件下,***不被滅活,可能對于細胞達到毒性水平。


o 一旦您在新鮮培養基中添加了血清和***時,您應該在兩到三周內使用它。因為一些***和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。


o 大部分添加物和試劑*多可以凍融 3 次,如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會影響它的性能。


o 在溶解的一周內使用貯存在 4℃ 冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在 4℃ 就可能開始降解,如果在室溫下放置超過 30 分鐘,就會變得不穩定。


o 為了保持 CO2 培養箱水盤清潔,需定期 (至少每兩周一次) 用無菌蒸餾水或無菌去離子水更換。

 


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